Rapports

" Animal Models and Experimental Design Considerations for Endocrine Disruptor Research and Testing "

Le volume 45(4) du Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) Journal présente une analyse et une discussion sur d'importantes questions ayant trait aux protocoles expérimentaux des recherches sur les perturbateurs endocriniens qui sont menées sur des animaux de laboratoire; on y définit également les principaux facteurs expérimentaux et environnementaux qui peuvent fausser les résultats de ces recherches. Ces articles fournissent de précieux renseignements sur le rôle des différents modèles utilisés pour les recherches sur les perturbateurs endocriniens chimiques, dans le cadre du programme EDSP (Endocrine Disruptor Screening Program) - ce programme a pour but d'identifier les perturbateurs endocriniens susceptibles d'avoir des effets nocifs chez les humains et des espèces animales importantes sur le plan écologique.

Considérations liées au protocole expérimental des études sur les perturbateurs endocriniens

Selon des données scientifiques, certaines substances chimiques pourraient se lier aux récepteurs des hormones endogènes et perturber de ce fait le fonctionnement normal du système endocrinien, ce qui augmenterait les risques de troubles et de cancer du système reproducteur chez les humains. Ces observations ont ouvert la voie à diverses initiatives internationales ayant pour but de détecter les produits chimiques à action endocrinienne qui pourraient avoir des effets sur la santé. Des études récentes ont toutefois démontré que les modèles animaux traditionnels, de même que les protocoles et les essais de toxicité " classiques ", n'avaient pas permis de déceler bon nombre des effets nocifs causés par certains perturbateurs endocriniens chimiques, en particulier les faibles effets nocifs sur le fœtus. La variabilité entre laboratoires est un autre problème important qui nuit à la reproductibilité et à l'interprétation des résultats, surtout des résultats associés à de faibles doses. Cette variabilité peut être due à divers facteurs, notamment au régime alimentaire type, qui est servi aux animaux de laboratoire utilisés pour les recherches sur le système endocrinien. Ce régime contient en effet des taux élevés et variables de phytoestrogènes (isoflavones dérivées du soja) qui peuvent moduler des réponses physiologiques et comportementales similaires à celles provoquées par les œstrogènes endogènes et exogènes. De fait, des études à court et à long termes ont révélé qu'un régime à base de phytoestrogènes a des effets précis sur l'ingestion d'aliments et d'eau, le dépôt de graisses, les taux sériques de leptine et d'insuline, ainsi que sur le processus d'apprentissage, la mémoire et les comportements reliés à l'anxiété. D'autres études devront être réalisées afin d'évaluer les effets des isoflavones alimentaires sur les processus de régulation de base qui contrôlent une série de réactions physiologiques et neuro-endocriniennes en cascade, dans les conditions normales et dans différentes conditions pathologiques. Les résultats obtenus laissent néanmoins sous entendre l'importance de déterminer et de contrôler la teneur en phytoestrogènes du régime alimentaire, non seulement pour les études sur les perturbateurs endocriniens, mais pour tous les types de recherches et d'essais réalisés sur des animaux, afin de réduire au minimum les effets potentiellement confusionnels et de maximiser la reproductibilité des résultats.

Le choix de la bonne espèce animale, et de la bonne souche ou du bon stock, est un autre important facteur à considérer pour les études sur les perturbateurs endocriniens. Les données expérimentales indiquent en effet que certains rats et souris exogames, pourtant fréquemment utilisés, sont moins sensibles aux œstrogènes que certaines lignées pures. Les auteurs insistent sur l'importance de tenir compte de la sensibilité de la souche ou du stock pour l'étude de paramètres précis du système endocrinien et donc de choisir une souche (un stock) sensible qui réduira au minimum la probabilité de faux négatifs.

Par ailleurs, alors que les différences dans le régime alimentaire et la sensibilité de la souche ou du stock sont des sources de variation bien connues dans les études sur les perturbateurs endocriniens, de nombreuses autres variations possibles, qui sont liées au milieu dans lequel sont logés ou testés les animaux de laboratoire, pourraient aussi fausser les résultats des recherches et des essais. Au nombre des variables confusionnelles possibles qu'il importe de sélectionner, normaliser et contrôler afin d'obtenir des résultats qui soient scientifiquement valables et reproductibles, mentionnons la gestion génétique, la présence de microbes et de pathogènes, le programme de sélection, les conditions de logement, les méthodes d'élevage, le régime alimentaire, le milieu physique (éclairage, température ambiante, humidité, macroenvironnement et microenvironnement) et le système de mise en cage.

Enfin, même si les effets de l'exposition à des perturbateurs endocriniens potentiels durant la grossesse ont fait l'objet de nombreuses études, ce n'est que récemment que des études ont démontré une sensibilité accrue du fœtus aux hormones endogènes, durant cette période critique du développement des organes et des systèmes. Ainsi, la proximité intrautérine de fœtus mâles et femelles a une incidence sur un certain nombre de caractères anatomiques, physiologiques et comportementaux sexuellement dimorphes. Il pourrait donc s'avérer important - dans le cadre de certaines études sur les perturbateurs endocriniens - d'observer ou d'estimer la position intra-utérine de chaque fœtus ou petit, afin d'obtenir une sensibilité et une spécificité optimales qui favorisent l'atteinte des objectifs de la recherche et des essais.

Modèles animaux pour les études sur les perturbateurs endocriniens

Le nombre de substances chimiques susceptibles d'avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien a progressé de façon exponentielle au cours des cinq à dix dernières années et, déjà, plus de 100 000 substances chimiques existantes et nouvelles figurent sur la liste des produits à évaluer. D'où l'importance de mettre en place un programme d'essais hiérarchisés rapides. C'est dans cette optique que le comité EDSTAC (Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee), mis sur pied par l'Environmental Protection Agency (EPA), a recommandé un protocole de dépistage et d'essais à plusieurs niveaux, devant servir à évaluer les effets œstrogènes, androgènes et thyroïdiens des substances chimiques commerciales et des contaminants environnementaux, nouveaux et existants. La batterie de tests de dépistage de niveau I vise à identifier les substances susceptibles d'avoir des effets perturbateurs sur le système endocrinien, qui devraient faire l'objet d'analyses plus approfondies; cette batterie a été conçue de manière à offrir des tests rapides et peu coûteux, plus sensibles que spécifiques. La batterie d'essais de niveau II a pour but d'identifier, de caractériser et de quantifier les effets nocifs des perturbateurs endocriniens chimiques, ainsi que de déterminer les relations dose réponse aux fins de l'évaluation des risques.

Les invertébrés sont des composantes essentielles de tout écosystème, qui sont utilisés avec succès depuis de nombreuses années pour des tests de dépistage et des essais biologiques. Les systèmes hormonaux uniques chez tous les phylums d'invertébrés, y compris les arthropodes, les mollusques et les nématodes, pour ne nommer que ceux-ci, offrent la possibilité d'étudier et d'identifier les perturbateurs endocriniens chimiques susceptibles d'avoir des effets sur des espèces d'invertébrés ayant une importance sur le plan écologique et économique. L'EPA a l'intention d'inclure des essais de toxicité couvrant le cycle de vie de la mysis (Mysidacés) ou d'autres invertébrés, dans la batterie de tests de niveau II. D'autres études en endocrinologie comparative devront être réalisées pour comprendre l'utilité et les limites de cette démarche.

Les essais sur le poisson représentent un autre volet important des programmes de dépistage et d'essai sur les perturbateurs endocriniens chimiques. L'uniformité génétique de ces souches contribue en effet à réduire au minimum la variabilité expérimentale qui est normalement associée aux autres espèces. Ainsi, les essais sur le cycle de vie partiel et complet du poisson, qui portent sur des aspects clés de la reproduction et du développement, offrent des modèles efficaces pour établir des prédictions quantitatives sur les risques écologiques associés aux perturbateurs endocriniens chimiques pour les populations de poisson et analyser les effets généralisés des perturbateurs endocriniens sur les vertébrés. L'EPA a proposé d'inclure des essais sur le poisson dans les batteries de tests de niveaux I et II.

Les oiseaux ont été l'une des premières espèces fauniques chez qui des effets perturbateurs du système endocrinien - alors attribués au pesticide DDT (dichlorodiphényltrichloroéthane) - ont été signalés. C'est ce qui explique que les essais évaluant la capacité de reproduction des oiseaux font habituellement partie du protocole d'homologation des pesticides. De fait, la batterie de tests de niveau II, du programme EDSP de l'EPA, inclut un essai de toxicité sur deux générations, qui prévoit une exposition des oiseaux durant les quatre stades critiques de leur vie (dans l'œuf, juvénile, jeune adulte et adulte) visant à évaluer quantitativement tout effet négatif associé à un présumé perturbateur endocrinien chimique. L'auteur a examiné le bien fondé d'inclure les oiseaux dans le programme EDSP et a défini les paramètres du protocole expérimental, ainsi que les principaux aspects de la méthode d'essai devant assurer une exposition adéquate durant les différents stades de vie. Il souligne également certains exigences générales des recherches, y compris certaines améliorations à apporter aux méthodes d'élevage et à la manipulation expérimentale des oiseaux, pour réduire les comportements confusionnels ainsi que la morbidité et la mortalité accidentelles.

Les effets biologiques de l'œstrogène sur les tissus cibles des mammifères jouent un rôle important dans le fonctionnement des systèmes qui comptent plusieurs organes, y compris les systèmes reproducteurs mâle et femelle, le système neuro-endocrinien, le système squelettique et le système cardio vasculaire. Les effets nocifs des perturbateurs endocriniens exogènes à action œstrogène ou anti œstrogène (ou les deux) sont donc très préoccupants, à la fois pour les humains et les animaux. Il faut cependant une connaissance parfaite des types, de la distribution et des fonctions des récepteurs des œstrogènes, pour estimer avec certitude les risques afférents à ces produits. Les modèles de souris génétiquement modifiées, qui ont récemment été mis au point en supprimant les gènes codant pour les récepteurs d'œstrogènes, offrent aux chercheurs et aux scientifiques un outil unique et très utile, pour évaluer le rôle de chaque récepteur dans les différents tissus, ainsi que les fonctions précises des différents récepteurs des œstrogènes dans des conditions physiologiques normales et physiopathologiques.

La batterie actuelle de tests de niveau I inclut des essais biologiques in vitro qui consistent en des essais de liaison aux récepteurs des œstrogènes et des androgènes, des essais de transactivation des gènes et des essais sur des extraits de testicules broyés ou d'autres essais in vitro (aromatase placentaire). Les essais de liaison aux récepteurs et de transactivation évaluent la capacité des agents exogènes d'imiter ou de bloquer l'action des ligands naturels des récepteurs des œstrogènes et des androgènes sur leurs récepteurs et de modifier la régulation hormonale en altérant l'expression génétique. Les essais sur les testicules broyés (tranchés) ont été conçus pour évaluer la capacité d'une substance de perturber n'importe laquelle des voies intracellulaires qui interviennent dans la biosynthèse de la testostérone par les gonades. Enfin, le dosage de l'aromatase placentaire vise à identifier les inhibiteurs précis des aromatases - ces enzymes qui catalysent la conversion des androgènes en œstrogènes. Le dosage de l'aromatase a été utilisé pour évaluer l'activité de différentes substances, notamment des pesticides comme l'atrazine, le diuron, le fénarimol et les organochlorés, les biphényles polychlorés, la TCDD, les composés organostanniques et les phytoestrogènes. Cependant, ces essais ne couvrent pas l'ensemble des voies par lesquelles la synthèse et le métabolisme des hormones stéroïdes peuvent être perturbés; de plus, ils nécessitent l'évaluation de l'effet négatif de la cytotoxicité sur la biosynthèse par les gonades et sur l'activité des aromatases. En général, les essais in vitro offrent plusieurs avantages, dont les suivants : bon rapport coûts efficacité, rapidité, reproductibilité (cohérence), capacité de traiter un grand nombre d'échantillons et indication du mécanisme d'action. Par contre, ces essais ne peuvent à eux seuls expliquer l'adsorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion des substances chimiques et ils ne devraient pas être utilisés directement pour l'évaluation des risques.

En raison des limites des essais in vitro, des essais in vivo ont dû être inclus dans les batteries de tests de dépistage et d'essais. Le rat de laboratoire est le modèle in vivo habituellement utilisé pour les études toxicologiques réglementaires et les recherches en endocrinologie, ainsi que pour les essais de toxicité sur le développement et la reproduction, ayant pour but de déterminer les effets négatifs potentiels sur la santé des humains et des animaux, aux fins de l'évaluation des risques pour la santé humaine. On procède actuellement à la normalisation et la validation de trois essais à court terme sur le rat, en vue des inclure dans la batterie de tests de niveau I du programme EDSP. Le premier est l'essai utérotrophique de trois jours sur le rat, conçu pour détecter les agonistes des œstrogènes en se basant sur l'induction ou l'inhibition de l'augmentation du poids de l'utérus. Le deuxième est l'essai de Hershberger sur dix jours, qui vise à détecter l'activité androgène et anti-androgène en mesurant les variations pondérales des tissus reproducteurs mâles. Enfin, le troisième est l'essai de 21 jours sur la maturation sexuelle des rates; cet essai consiste à déterminer l'âge des rates à l'ouverture du vagin, ainsi qu'à mesurer les taux sériques d'hormones thyroïdiennes et le poids de l'utérus et des ovaires et à évaluer des paramètres histologiques. Cet essai s'est révélé hautement reproductible et très sensible pour déterminer les perturbateurs endocriniens chimiques susceptibles d'avoir une activité anti-thyroïdienne et œstrogène ou d'inhiber la stéroïdogenèse. Parmi les autres essais en cours d'évaluation en vue d'une inclusion possible dans la batterie de tests de niveau I, mentionnons l'essai sur la puberté chez le rat mâle ainsi qu'un essai in utero et durant la lactation au cours duquel l'exposition se produit durant la gestation et la lactation. Le rat est également le modèle animal qui a été choisi pour les essais multigénérationnels de niveau II sur les mammifères, dans le cadre du programme EDSP. Ces essais consistent à exposer les animaux durant tous les stades critiques de leur développement et à évaluer la fonction de reproduction des animaux exposés in utero. D'autres méthodes devront maintenant être mises au point pour détecter la perturbation des œstrogènes, des androgènes et des hormones thyroïdiennes.

L'EPA est actuellement à définir les exigences qui régiront les tests de dépistage et les analyses de milliers de pesticides, produits chimiques commerciaux et contaminants environnementaux, susceptibles de perturber le système endocrinien. Il convient toutefois de rappeler qu'un grand nombre de facteurs expérimentaux peuvent facilement moduler le système endocrinien et qu'il importe donc de choisir avec soin le modèle animal et le protocole expérimental utilisés pour les recherches et les analyses sur la perturbation endocrinienne, afin de réduire au minimum les variables expérimentales confusionnelles, d'accroître la reproductibilité des résultats expérimentaux et d'obtenir des méthodes d'analyse plus fiables et plus pertinentes. D'autres méthodes, comme les essais in vitro, les techniques informatiques et l'utilisation d'organismes non mammifères jouent également un rôle de plus en plus important dans ce processus. Enfin, les scientifiques continuent d'élaborer, de mettre au point et de valider de nouvelles méthodes de dépistage et d'analyse, dans le but d'améliorer notre capacité de prévoir les effets nocifs des substances chimiques existantes et nouvelles, d'évaluer le bien être des animaux et de réduire encore davantage le nombre d'animaux devant être utilisés pour les essais.